Record Details

METHODOLOGICAL APPROACHES TO DETECTION AUTOPHAGY IN MUSCLE CELLS

Translational Medicine

View Archive Info
 
 
Field Value
 
Title METHODOLOGICAL APPROACHES TO DETECTION AUTOPHAGY IN MUSCLE CELLS
МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ДЕТЕКЦИИ ПРОЦЕССА АУТОФАГИИ В МЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ
 
Creator K. Sukhareva S.; Peter the Great Saint-Petersburg Polytechnic University
N. Smolina A.; Federal Almazov North-West Medical Research Centre
A. Golovkin S.; Federal Almazov North-West Medical Research Centre
A. Khudyakov A.; Federal Almazov North-West Medical Research Centre
A. Knyazeva A.; Peter the Great Saint-Petersburg Polytechnic University
A. Mishanin L.; Federal Almazov North-West Medical Research Centre
A. Kostareva A.; Federal Almazov North-West Medical Research Centre
К. Сухарева С.; Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого»
Н. Смолина А.; Федеральное государственное бюджетное учреждение «Северо-Западный Федеральный медицинский исследовательский центр им. В. А . Алмазова» Минздрава России
А. Головкин С.; Федеральное государственное бюджетное учреждение «Северо-Западный Федеральный медицинский исследовательский центр им. В. А . Алмазова» Минздрава России
А. Худяков А.; Федеральное государственное бюджетное учреждение «Северо-Западный Федеральный медицинский исследовательский центр им. В. А . Алмазова» Минздрава России
А. Князева А.; Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого»
А. Мишанин И.; Федеральное государственное бюджетное учреждение «Северо-Западный Федеральный медицинский исследовательский центр им. В. А . Алмазова» Минздрава России
А. Костарева А.; Федеральное государственное бюджетное учреждение «Северо-Западный Федеральный медицинский исследовательский центр им. В. А . Алмазова» Минздрава России
 
Subject autophagy; cell death; muscle cell
аутофагия;клеточная гибель;мышечные клетки
 
Description Introduction. Autophagy is a process, whereby components of cell undergo degradation influenced by lysosomal enzymes leading to autophagosome formation. Nowadays, autophagy is considered as one of the application point in range of pharmological approaches, particularly, in inherited orphan diseases and also in aging, and heart failure. O bject of research and properties of examined cell culture have the essential meaning for methodological evaluation of autophagy. In this work, we present selection of optimal conditions for evaluation of autophagy progress in C2C12 cell line.Methods. To select the optimal approach to evaluate autophagy progress, we tested flow cytometry, immunocytochemistry, and immunoblot (Western blot). T o choose the optimal conditions of cell membrane permeabilization performance various detergents, temperature conditions, time of cell fixation, and components of lysis buffer were compared.Results. We report, that application of 0,025% digitonin is decisive condition to extract separate protein LC3 fractions (soluble and insoluble). Samples fixation and reduced time of washing are necessary for flow cytometry and allow to maintain optimal number of cells for analysis based on detergent application. We consider, that applying of cell transfection with constructs, carrying LC3, can lead to increase the required time of serum deprivation.Conclusions. O ptimized protocols for evaluation of autophagy in C2C12 cells over detection of separate fractions of LC3 can be effectively used in investigation of fundamental molecular and cellular mechanisms of myopaties and cardiomyopaties development.
Введение. А утофагия — процесс, при котором компоненты клетки подвергаются деградации под действием лизосомальных ферментов, в результате чего формируется аутофагосома. В настоящее время процесс аутофагии рассматривается как одна из точек приложения ряда фармакологических подходов, в частности, при наследственной, орфанной патологии, а также при старении и сердечной недостаточности. Существенное значение для методической оценки процесса аутофагии имеет объект исследования и свойства изучаемой клеточной культуры. В данной работе проводился подбор оптимальных условий оценки процесса аутофагии в мышечных клетках мыши линии C2C12.Методы. В работе проводился подбор условий для реализации таких методов оценки аутофагии, как проточная цитометрия, иммуноцитохимия и иммуноблотинг (Western Blot). Проводился поиск оптимальных условий пермеабилизации клеток различными детергентами, подбор температурных условий, времени фиксации материала и компонентов лизирующих растворов.Результаты. Показано, что обязательным условием раздельной экстракции белка LC3 из растворимой и нерастворимой цитоплазматической фракции является применение детергента дигитонина в концентрации 0,025%. При проведении проточной цитометрии обязательными являются фиксация образцов и сокращенное время отмывки, позволяющее сохранить оптимальное количество клеток для анализа на фоне применения детергентов. Показано, что использование трансфекции клеток плазмидой, несущей LC3, приводит к увеличению необходимого времени сывороточной депривации.Выводы. О птимизированные протоколы оценки процесса аутофагии при помощи детекции раздельных фракций белка LC3 в клетках мышечной линии С2С12 могут быть эффективно использованы при изучении фундаментальных молекулярных и клеточных механизмов развития миопатий и кардиомиопатий.
 
Publisher Federal Almazov North-West Medical Research Centre, Saint Petersburg, Russia
 
Contributor —
—
 
Date 2017-01-31
 
Type info:eu-repo/semantics/article
info:eu-repo/semantics/publishedVersion
—
—
 
Format application/pdf
 
Identifier http://transmed.almazovcentre.ru/jour/article/view/234
 
Source Translational Medicine; Том 3, № 5 (2016); 129-137
Трансляционная медицина; Том 3, № 5 (2016); 129-137
2410-5155
2311-4495
 
Language rus
 
Relation http://transmed.almazovcentre.ru/jour/article/view/234/228
Elliott P, Andersson B, Arbustini E et al. Classification of the cardiomyopathies: a position statement from the European Society O f Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. Eur Heart J. 2008; 29(2):270-276.
Vanderpluym C, Graham D, Almond C et al. Survival in patients removed from the heart transplant waiting list before receiving a transplant. J Heart Lung T ransplant. 2014; 33(3):261- 269.
Bhuiyan M, Pattison J, O sinska H et al. Enhanced autophagy ameliorates cardiac proteinopathy. J Clin Invest. 2013; 123(12):5284-5297.
De Palma C, Morisi F, Cheli S et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 2012; 3:e418.
Jimenez R, Kubli D, Gustafsson A. Autophagy and Mitophagy in the Myocardium:Therapeutic Potential and Concerns. Br J Pharmacol. 2013; 171(8):1907-1916.
Kaminskyy V, Abdi A, Zhivotovsky B. A quantitative assay for the monitoring of autophagosome accumulation in different phases of the cell cycle. Autophagy. 2011; 7 (1):83–90.
Aits S, Jäättelä M, Nylandsted J. Methods for the quantification of lysosomal membrane permeabilization: a hallmark of lysosomal cell death. Methods Cell Biol.2015; 126:261–85.
Gottlieb R, Andres A, Sin J et al. U ntagling autophagy measurements. All Fluxed U p. Circ. Res.2015; 116:504–515.
Agholme L, Agnello M, Agostinis P et al. Guidlines for the use and interpretation of assas for monitoring autophagy. Autophagy. 2012; 8(4):445–544.
Puleston D, Phadwal K, Watson A et al. T echniques for the Detection of Autophagy in Primary Mammalian Cells. Cold Spring Harb. Protoc. 2015(9).
 
Rights Authors who publish with this journal agree to the following terms:Authors retain copyright and grant the journal right of first publication with the work simultaneously licensed under a Creative Commons Attribution License that allows others to share the work with an acknowledgement of the work's authorship and initial publication in this journal.Authors are able to enter into separate, additional contractual arrangements for the non-exclusive distribution of the journal's published version of the work (e.g., post it to an institutional repository or publish it in a book), with an acknowledgement of its initial publication in this journal.Authors are permitted and encouraged to post their work online (e.g., in institutional repositories or on their website) prior to and during the submission process, as it can lead to productive exchanges, as well as earlier and greater citation of published work (See The Effect of Open Access).
Авторы, публикующие в данном журнале, соглашаются со следующим:Авторы сохраняют за собой авторские права на работу и предоставляют журналу право первой публикации работы на условиях лицензии Creative Commons Attribution License, которая позволяет другим распространять данную работу с обязательным сохранением ссылок на авторов оригинальной работы и оригинальную публикацию в этом журнале.Авторы сохраняют право заключать отдельные контрактные договорённости, касающиеся не-эксклюзивного распространения версии работы в опубликованном здесь виде (например, размещение ее в институтском хранилище, публикацию в книге), со ссылкой на ее оригинальную публикацию в этом журнале.Авторы имеют право размещать их работу в сети Интернет (например в институтском хранилище или персональном сайте) до и во время процесса рассмотрения ее данным журналом, так как это может привести к продуктивному обсуждению и большему количеству ссылок на данную работу (См. The Effect of Open Access).